1. Исследование фенотипических и
функциональных характеристик NK-клеток
Савицкий Валерий, к.б.н. Специалист по проточной цитометрии,
Бекмен Культер , Москва

2. Приложения
- Фундаментальные исследования
- Клинические тесты
- Клинические исследования –
экспериментальная терапия
(трансплантация стволовых клеток / GvL)

3. Мониторинг иммунитета – субпопуляции лимфоцитов
Врожденный Приобретенный иммунный ответ
иммунный ответ
T8
T B
CD3+CD8+ CD19+
NK CD3+
PC
CD3-CD56+ T4 CD3+CD4+ CD38++
memB CD138+
Treg CD27+IgM+ (-)
FoxP3+
CD25++CD127+/- TH1 TH2 TH17 IL17
IFN IL-4
IL-2 IL-6
TNF IL-10
3

4. Биологические функции NK-клеток
Eric Vivier et al. Science 331, 44 (2011);

5. Морфологическая характеристика NK-клеток
Human CD3-,CD56+ Human CD3-,CD56+
• 5-25% (100-600 кл/мкл) лимфоцитов периферической крови

6. Иммунофенотипическая идентификация
NK-клеток

8. Субпопуляции NK-клеток (1)
Незрелые
НК
Зрелые НК

9. Субпопуляции NK-клеток (2)

10. Функциональные тесты
(классический)
Handbook of Human Immunology Ch 10

11. Функциональные тесты:
Экспрессия CD107a

12. Функциональные тесты:
экспрессия CD107a

13. Функциональные тесты:
экспрессия CD107a и экспрессия цитокинов
Sensitivity >> Cytokine Assay

14. Изменение соотношения субпопуляций
NK-клеток после трансплантации
A. Schulze et al. / Experimental Hematology - (2008)

15. Ингибирующие рецепторы
Name Alternative Name[s] Cellular Ligand
p58.1 KIR2DL1 HLA-Cw2,4,5,6
p58.2 KIR2DL2 HLA-Cw1,3,7,8
p70 KIR3DL1 HLA-Bw4
p140 KIR3DL3 HLA-A3, -A11
p49 KIR2DL4 HLA-G
LIR1 ILT2/LILRB1 HLA-G
LIR2 ILT4/LILRB2 HLA-F
CD94* KLRD1 HLA-E**
NKG2A KLRC1/CD159A HLA-E
NKR-P1B, D CD161B, D Clrb
p40 LAIR1 ?
IRC1 IRp60/CMRF35H ?
p75AIRM1 Siglec-7 Sialylated sugars
*CD94 forms heterodimers with NKG2A, -C and –E
**CD94/CD159A heterodimer is specific for HLA-E

16. Активирующие рецепторы
Name Alternative Name[s] Cellular Ligand
NKp46 Ly94/NCR1 ?
NKp30 IC7/NCR3 ?
NKp44 Ly95/NCR2 ?
2B4 CD244 CD48
NTB-A KALI ?
NKp80 KLRF1 ?
CD16 Fc RIII IgG
CD2 LFA-2 CD58, LFA-3
DNAM-1 CD226 PVR/CD155, Nectin-2/CD112
NKG2D D12S2489E/CD159D MICA, MICB, MULT1 ULBP1-4
NKR-P1A CD161A [IC-21]*
NKR-P1C CD161C ?
NKR-P1F CD161F Clrg
P40 LAIR1 ?
IRC1 IRp60/CMRF35H ?
p75AIRM1 Siglec-7 Sialylated sugars
*Rat NKR-P1A binds an undefined determinant on IC-21 tumor cells

17. NK-клетки. Экспериментальная терапия
Аллогенная трансплантация / Эффект трансплантат против лейкоза:
- Mismatch KIR NK клеток донора
- сниженная частота рецидивов
- увеличение продолжительности жизни
- снижение РТПХ

18. Клеточная терапия с
использованием NK-клеток
Eric Vivier et al. Science 331, 44 (2011);

19. Динамическая регуляция эффекторной
функции NK-клеток
Цитотоксическая активность НК клетокопределяется
балансом связывания активирующих и ингибирующих
рецепторов/лигандов
Eric Vivier et al. Science 331, 44 (2011);

20. Концепция аллореактивности NK-клеток
(лейкоз)
У пациентов с ОМЛ НК клетки утрачивают
способность распознавать и уничтожать
аутологичные бласты
Альтернатива – донорские НК клетки, лучше
распознающие бласты. Механизм - mis-matching
ингибиторных рецепторов и их MHC лигандов
(эффект трансплантат против лейкоза)

21. Влияние аллореактивности трансплантированных НК
клеток на вероятность выживаемости пациентов с ОМЛ
.
Ruggeri L et al. Blood. 2007;110:433-40.

22. Пример панели для иммунофенотипирования NK-
клеток (Navios,10параметров – 1 пробирка)

23. Стратегия гейтирования

24. Коэкспрессия экспрессия KIR NK-клетками

25. Экспрессия ингибирующих и активирующих
рецепторов субпопуляциями НК клеток

26. Иммунофенотипическая оценка результатов
обработки клеток. Контроль сепарации
Before
After

27. Иммунофенотипическая оценка результатов
обработки клеток. Контроль активации

28. The World of NK Cells is known at BC
+NTB-A
+CD107a

29. Савицкий Валерий, к.б.н. Специалист по прточной цитометрии , Бекман Культер , Москва
29
vsavitski@beckman.com